Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 34 стр.

     К 0,25 мл супернатанта добавить 0,375 мл 0,5 М натрий-фосфатного
буфера (рН 7,5), после этого добавить 12 мкл дистиллированной воды (эту
пробу использовать для определения общего содержания глутатиона)
     К 0,25 мл супернатанта добавить 0,375 мл 0,5 М натрий-фосфатного
буфера (рН 7,5), после этого ПОД ТЯГОЙ в ПЕРЧАТКАХ добавить 12 мкл 2-
винилпиридина    (97%    2-винилпиридин,    стабилизированный      0,1%   4-
третбутилкатехолом) для маскировки восстановленной формы глутатиона.
Плотно закрыть крышкой и хорошо встряхнуть до образования эмульсии,
после чего инкубировать при комнатной температуре в темноте 1 ч под тягой.
Этот образец используют для определения содержания GSSG.
     Реакционная смесь на 10 образцов содержит:
     6 мл 0,18% раствора Na-ЭДТА в фосфатном буфере
     1 мл 0,16% раствора НАДФН
     2 мл 0,12% раствора 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты)
     Для проведения реакции непосредственно перед измерением в пробирку
внести 0,9 мл реакционной смеси, затем добавить:
     0,1 мл экстракта
     2 мкл глутатион редуктазы.
     Контрольная кювета содержит все реагенты, кроме экстракта и
фермента глутатионредуктазы. Готовится 1 раз для всех образцов. Измерение
оптической плотности проводят ежесекундно в течение 1 мин при длине волны
412 нм.
     Построение калибровочной кривой
     Для построения калибровочной кривой используют сток-растворы GSSG
и GSH:
100 мкМ GSH (3 мг GSH растворить в 10 мл mQ)
100 мкМ GSSG (3 мг GSSG растворить в 5 мл mQ).
     В реакционную смесь вместо экстракта добавляют глутатион в заданной
концентрации:
     1 мкМ - 10мкл из сток-раствора

                                       34