Хроматографические методы в анализе лекарственных и токсичных веществ. Стоянова О.Ф - 47 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

47
5. Пинцет.
6. Сушильный шкаф .
7. Растворитель: смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и
дистиллированной водой в объемном соотношении 4:1:5.
8. Проявитель: 200 мг нингидрина в 100 мл ацетона.
9. Аминокислоты : аланин, лизин, валин, тирозин, аспарагиновая и
глутаминовая кислоты – стандартные растворы с концентрацией
0,01 моль/ л.
10. Анализируемый белковый гидролизат.
Выполнение работы
Подготовка хроматографической бумаги . Вырезают полоски
хроматографической бумаги длиной 30 см и шириной , соответствующей
ширине хроматографической камеры . Снизу на расстоянии 4 см
карандашом проводят стартовую линию . Отступив от края линии на 2 см ,
отмечают первую точку. Стандартные растворы аминокислот и
анализируемый белковый гидролизат наносят на линию старта на
расстоянии 2-3 см друг от друга .
Хроматографирование . Пробы объемом 0,01 мл наносят
микропипеткой путем прикосновения к бумаге в два приема по 0,005 мл в
одну и ту же точку. Диаметр капли на бумаге не должен превышать 3 мм.
Хроматограммы подсушивают в сушильном шкафу и помещают в
хроматографическую камеру с растворителем . При этом нижний край
хроматограмм погружают в растворитель на 1-1,5 см . Растворитель
пропускают через бумагу в течение 3 ч. Для разделения аминокислот
необходимо 3-кратное пропускание растворителя с периодическим
высушиванием хроматограмм.
Затем хроматограммы извлекают из камеры , отмечают фронт
движения растворителя и помещают в сушильный шкаф (70
о
С) на 10-15
мин. Хроматограммы проявляют раствором нингидрина в ацетоне
( опрыскивают из пульверизатора), нижний край хроматограмм
поддерживают пинцетом , чтобы лист бумаги располагался вертикально.
После этого хроматограммы подсушивают в сушильном шкафу при 70
о
С в
течение 15 мин . При проявлении хроматограмм появляются пятна
сиренево-фиолетового цвета на некотором расстоянии друг от друга .
Качественный анализ аминокислот проводят путем сопоставления
положения пятен стандартных растворов аминокислот и анализируемого
гидролизата. Для этого рассчитывают величину R
f
для каждой
аминокислоты как отношение пути, пройденного аминокислотой
( расстояние от линии старта до центра пятна), к пути, пройденному
растворителем (расстояние от линии старта до границы смещения
растворителя ). Каждая аминокислота при одинаковых условиях
эксперимента имеет постоянную величину R
f
. Сравнение этих величин,
характеризующих смещение зон аминокислот стандартных растворов и 
                                      47
      5. П инцет.
      6. Суш ильны й ш каф.
      7. Раств оритель: смесь бутилов ого спирта с уксусной кислотой и
          д истиллиров анной в од ой в объемном соотнош ении 4:1:5.
      8. П роя в итель: 200 мгнинг  ид рина в 100 млацетона.
      9. А минокислоты : аланин, лиз ин, в алин, тирозин, аспарагинов ая и
          глутам инов ая кислоты – станд артны е раств оры с концентрацией
          0,01 моль/л.
      10. А нализ ируемы й белков ы й гид ролиз ат.

       Вы полне ни е ра бот ы
       П од готов ка хроматог   рафической бумаг      и. В ы рез ают полоски
хроматографической бумаги д линой 30 см и ш ириной, соотв етств ующ ей
ш ирине хроматог     рафической камеры . Сниз у на расстоя нии 4 см
каранд аш ом пров од я т стартов ую линию. О тступив от края линии на 2 см,
отмечают перв ую точку. Станд артны е раств оры аминокислот и
анализ ируем ы й белков ы й г    ид ролиз ат нанося т на линию старта на
расстоя нии 2-3 см д руготд руг   а.
       Х роматографиров ание. П робы         объемом      0,01 мл нанося т
микропипеткой путем прикоснов ения к бумаге в д в а приема по0,005 мл в
од нуи туже точку. Д иаметр капли набумаг      е не д олжен прев ы ш ать3 м м.
       Х роматограммы под суш ив ают в суш ильном ш кафу и помещ ают в
хроматографическую камеру с раств орителем. П ри э том нижний край
хроматограмм пог      ружают в раств оритель на 1-1,5 см. Раств оритель
пропускают через бумаг       у в течение 3 ч. Д ля раз д еления аминокислот
необход имо 3-кратное пропускание раств орителя с период ическим
в ы суш ив анием хроматог   рамм.
       Затем хроматог     раммы из в лекают из камеры , отмечают фронт
д в ижения раств орителя и помещ ают в суш ильны й ш каф (70 оС) на 10-15
мин. Х роматог     раммы проя в ля ют раств ором нингид рина в ацетоне
(опры скив ают из пульв ериз атора), нижний край хроматограмм
под д ержив ают пинцетом, чтобы лист бумаг       и располагался в ертикально.
П осле э тог охроматог   раммы под суш ив аютв суш ильном ш кафупри 70 оС в
течение 15 мин. П ри проя в лении хроматог           рамм поя в ля ются пя тна
сиренев о-фиолетов ог   оцв етананекотором расстоя ниид руготд руг     а.
        К ачеств енны й анализ ам инокислот пров од я т путем сопостав ления
положения пя тен станд артны х раств оров аминокислот и анализ ируемого
гид ролиз ата. Д ля э тог    о рассчиты в ают в еличину Rf д ля кажд ой
аминокислоты как отнош ение пути, пройд енног               о аминокислотой
(расстоя ние от линии старта д о центра пя тна), к пути, пройд енном у
раств орителем (расстоя ние от линии старта д о г           раницы смещ ения
раств орителя ). К ажд ая ам инокислота при од инаков ы х услов ия х
э ксперимента имеет постоя нную в еличину Rf. Срав нение э тих в еличин,
характериз ующ их смещ ение з он аминокислотстанд артны х раств оров и

Страницы