ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
ролиза вещества, в которых наблюдается линейная зависимость между активностью фермента и коли-
чеством образующегося продукта. Наиболее точен потенциометрический метод.
Однако использование инструментальных методов анализа не всегда возможно, поэтому для обна-
ружения образующейся кислоты используют кислотно-основные индикаторы. К числу последних мож-
но отнести бромтимоловый синий, который дает четкий интервал перехода от синего (рН = 0,7) до жел-
того (рН = 7,2). По времени перехода окраски индикатора можно определить активность холинэстеразы
по количеству образующейся в процессе ферментативного гидролиза масляной (бутановой) кислоты.
Колориметрические методы с рН-индикатором широко используются в военно-химическом деле.
По данному методу пробу, содержащую фермент, смешивают с субстратом и соответствующим инди-
катором и определяют время, в течение которого окраска пробы становится одинаковой с цветом этало-
на (стандарта).
Как и любой фермент, холинэстераза обладает различной активностью в зависимости от температу-
ры, значения рН среды, количества реагирующих веществ и т.д.
Ход работы
1 Влияние температуры.
В пробирки 1−5 налить по 0,5 мл раствора холинэстеразы и 1 мл буфера. Затем пробирку 1 ос-
тавить при комнатной температуре, остальные пробирки поместить в водяную баню с температу-
рой: 2…30 °С, 3…40 °С, 4…50 °С, 5 – на кипящую водяную баню. Выдержать в указанных услови-
ях 7–10 мин, затем в каждую пробирку добавить по 0,5 мл раствора бутирилхолинйодида (БХИ) и
по 2 капли индикатора бромтимолового синего (БТС). Пробирки вновь поместить в термостат при
заданной температуре и записать время изменения цвета раствора до цвета стандарта. Сделать вы-
вод об оптимальном значении температуры.
2 Влияние рН среды.
В пробирки 1−3 налить по 0,5 мл раствора холинэстеразы и 1 мл буфера. Затем добавить: в пробир-
ку 1 − 3 капли 1% раствора карбоната натрия, в пробирку 2 – 3 капли серной кислоты (разб.). Пробирки
поместить в водяную баню с теплой водой (37…40 °С) на 10 мин, затем добавить по 0,5 мл раствора
БХИ и по 2 капли БТС. Пробирки вновь поместить в водяную баню и зафиксировать время изменения
цвета растворов до цвета стандарта. Сделать вывод о влиянии рН среды на скорость ферментативного
гидролиза, на активность холинэстеразы.
3 Влияние количества субстрата.
В пробирки 1−3 поместить по 0,5 мл раствора холинэстеразы и 1 мл буфера. Пробирки помес-
тить в стакан с теплой водой (37…40 °С) на 10 мин, затем добавить: в 1 – 0,5 мл раствора БХИ, во 2
– 1 мл раствора БХИ, в 3 – 1,5 мл раствора БХИ. В каждую пробирку прилить 2 капли раствора БТС
и поместить все 3 пробирки в стакан с теплой водой. Зарегистрировать время изменения цвета рас-
твора до цвета стандарта и сделать вывод о влиянии количества субстрата на скорость реакции.
4 Влияние количества фермента.
В пробирки 1–3 поместить по 1 мл раствора буфера, затем в 1 прилить 0,5 мл раствора ХЭ, во 2
– 1 мл раствора ХЭ, в 3 – 1,5 мл раствора холинэстеразы. Пробирки поместить в стакан с теплой во-
дой (37…40 °С) на 10 мин, затем в каждую добавить по 0,5 мл раствора БХИ и 2 капли раствора
БТС.
Пробирки вновь поместить в стакан с теплой водой (37…40 °С) и зафиксировать время перехо-
да окраски раствора до цвета стандарта. Сделать вывод о влиянии количества раствора холинэсте-
разы на скорость гидролиза.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 46
- 47
- 48
- 49
- 50
- …
- следующая ›
- последняя »
