Практикум по биологической химии. Володина Г.Б. - 49 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ТГТУ | Тамбов

Составители: 

Рубрика: 

5 Исследование ингибирующего действия фосфорорганических соединений на фермент
холинэстеразу.
Основная реакция, на которой основано определение ингибирующего действия фосфороргани-
ческих веществ на ХЭ, следующая:
Бутирилхолинйодид Масляная Холинйодид
кислота
В 1 опыте определяют активность холинэстеразы.
Определение активности холинэстеразы основано на реакции ферментативного гидролиза БХИ по
обнаружению продуктов реакции бутановой (масляной) кислоты. Для определения бутановой кислоты в
исследуемый раствор вводят индикатор – БТС, который изменяет цвет от синего до желтого (в слабоки-
слой среде).
В пробирки 1−4 приливают по 0,5 мл раствора холинэстеразы, затем в 1 пробирку добавляют 0,5 мл
буфера, во 2 – 1 мл буфера, в 3 – 1,5 мл буфера, в 4 – 2 мл буфера. Пробирки закрывают пробками и по-
мещают в стакан с теплой водой (37−40°С) на 10 мин Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл
раствора БХИ и 2 капли раствора бромтимолового синего. Пробирки вновь помещают в стакан с теплой
водой нужной температуры и регистрируют время изменения цвета раствора до цвета стандарта. По ре-
зультатам эксперимента заполняют таблицу.
Номер пробирки 1 2 3 4
Объем ХЭ, мл 0,5 0,5 0,5 0,5
Объем буфера, мл 0,5 1,0 1,5 2,0
Объем раствора БХИ 0,5 0,5 0,5 0,5
Время
Для проведения дальнейших опытов выбирают то количество буфера (см. номер пробирки), ко-
торое позволяет проводить реакцию в течение 7 − 9 мин.
В ы в о д: в пробирке ____, содержащей 0,5 мл раствора ХЭ и х мл буфера, время изменения цвета
раствора составляет _____ мин.
Во 2 опыте исследуют угнетение холинэстеразы фосфорорганическим веществом.
В две пробирки помещают по 0,5 мл ХЭ и х мл буфера. Затем в одну из пробирок (рабочую) добав-
ляют 2 капли раствора хлорофоса. Обе пробирки помещают в водяную баню (36…39 °С) на 10 мин.
Затем в каждую добавляют по 0,5 мл БХИ и одной капле БТС. Отмечают время выравнивания цвета
раствора в контрольной и рабочей пробирках (τ
к
и τ
раб
).
Рассчитывают процент угнетения ХЭ по формуле
y
%100%100(%)
раб
к
⋅
τ
τ
−=
.
Контрольные вопросы
1 Правила техники безопасности при выполнении работы.
2 Понятие о ферментах.
3 Классификация ферментов.
4 Строение фермента.
5 Как можно обнаружить присутствие фермента в исследуемом материале?
6 Перечислите основные факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
7 Чем обусловлена специфичность ферментов?

Страницы