Большой практикум по биоэкологии. Ч. 1. Воскресенская О.Л - 69 стр.

        2. Навеску растительного материала (50–100 мг) растирают в
ступке с водой, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят дистил-
лированной водой до метки.
        3. Растительную вытяжку настаивают в течение 5-10 минут, а
затем центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об./мин (центрифуги-
рование можно заменить фильтрованием). Фильтрат или надосадочную
жидкость используют для определения пероксидазной активности.
        4. Для определения активности фермента берут две кюветы
толщиной 1 см. По первой кювете (контроль) устанавливают ноль при-
бора (ФЭК), регулируя переключатели «чувствительность» (1, 2, 3) и
«установка нуля». В контрольную кювету помещают 2 мл бензидина, 2
мл фильтрата и 2 мл воды. Стрелка прибора должна находиться в поло-
жении «0». Определение проводят с красным светофильтром при длине
волны λ=670 нм.
        5. Во вторую кювету (опыт) вливают 2 мл бензидина, 2 мл
фильтрата и 2 мл 0,3%-ный раствор H2О2, при этом сильная струя пере-
киси перемешивает содержимое кюветы. Добавление H2О2 служит стар-
том реакции.
        6. Одновременно с вливанием пероксида водорода включают
секундомер. В опытной кювете раствор синеет, стрелка прибора пере-
двигается справа налево. Отмечают время, за которое стрелка достигает
0,2 делений прибора (ед. оптической плотности). Это время должно
находиться в пределах от 20 до 50 секунд.
        7. Если активность фермента низкая, то есть стрелка прибора до-
стигает значений 0,2 за более длительное время (более 1-2 мин), тогда
можно вести отсчет до 0,1 ед. оптической плотности. Если активность фер-
мента высокая, тогда следует разбавить вытяжку. В этом случае в кювету
вливают не 2 мл фильтрата, а 1 мл и добавляют 1 мл воды.
        8. Активность пероксидазы рассчитывают по формуле:
                               Д ,
                                t d
где Д – оптическая плотность (0,1–0,2);
    Е – разведение (перерасчет на 1 г сырой массы);
    t – время, с;
    d – толщина слоя жидкости, толщина кюветы (1 см).
         Активность пероксидазы выражают в единицах оптической
плотности на грамм сырой массы в секунду (∆Д670г-1·с-1).
         Пример расчета разведения. Для опыта была взята навеска 100 мг или 0,1
г, которую перенесли в колбу на 25 мл. Непосредственно для определения активно-
сти фермента было взято 2 мл вытяжки, что соответствует 25:2=12,5 частей всей вы-
тяжки или 100:12,5=8 мг навески. Данная вытяжка имеет определенную фермента-
тивную активность «а», тогда составляется пропорция:

                                                                              69