Большой практикум по биоэкологии. Ч. 1. Воскресенская О.Л - 76 стр.

         Ход работы:
         1. Готовят ферментативную вытяжку, для чего 2–3 г навески расти-
рают в ступке с дистиллированной водой и доводят объем до 10 мл.
         2. Берут 2–3 мл ферментативной вытяжки, приливают 1 мл 0,2М
трис-HCl буфера (pH=7,8) и выдерживают при температуре 25°С 15 мин. За-
тем приливают 0,5 мл 0,005М раствора АТФ и 0,5 мл 0,005М MgSO4.
         3. Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин.
         4. Одновременно готовят холостой опыт, для этого в контрольные
пробирки добавляют все те же растворы, кроме АТФ (субстрата реакции).
         5. Пробирки из термостата вынимают и в каждую пробирку для
осаждения белков (инактивации фермента) добавляют по 1 мл 20%-го
раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и ставят на 30 мин в холо-
дильник. В холостой опыт добавляют 0,5 мл 0,005М раствора АТФ.
         6. Профильтровывают, и фильтрат используют для определения
фосфора. Активность фермента измеряют по количеству образовавшегося
неорганического фосфора, отщепленного от аденозинтрифосфата АТФ-азой.
Активность фермента выражают в мкг P·г-1 сырой массы·ч-1.
         Активность АТФ-азы рассчитывают по формуле:          (О К ) ,

где О – количество Рн в опытных образцах;
    К – количество Рн в холостом опыте;
    Т – время, ч;
    Е – разведение (перерасчет на навеску).
          Пример расчета разведения: 2 г навески растирали и довели объем до 10
мл. Непосредственно для определения АТФ-азы взяли 2 мл, тогда 10:2=5, т.е. разве-
дение в 5 раз или это соответствует 2 г:5=0,4 г навески. Данная вытяжка (0,4 г) имела
определенную АТФ-азную активность «а», можно составить пропорцию:
                    0,4 - а                                  1,0 а
                                                        Х              2,5 а
                    1,0 - х                                   0,4
         Т.о. формулу вместо Е ставим 2,5.
        7. Определение фосфора (см. стр. 44).
        8. Фильтрат в объеме 5 мл полученного раствора переносят в
мерную колбу на 50 мл и доводят до метки реактивом С, колба стоит 30
мин, затем ее колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром при
длине волны =670 нм.
        9. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 30.
                                                          Таблица 30
                     Определение активности АТФ-азы
  Варианты        № колб        Навеска, г       Показания           Активность
   опыта                                          прибора             АТФ-азы



76