Биохимия. Березовская В.А. - 60 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

КамчатГТУ | Петропавловск-Камчатский

Составители: 

Рубрика: 

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
4.1. Приготовление мышечного экстракта.
На технических весах взвешивают 10 г мышечной ткани све-
жей рыбы или мяса и помещают в охлажденную, стоящую на
льду ступку. Отмеряют 50 мл охлажденного 0,04 М раствора ни-
котинамида и заливают им взятую навеску. Затем мышцы из-
мельчают ножницами, добавляют кварцевый песок, растирают
в ступке до получения гомогенной массы и экстрагируют
30–40 мин. После этого полученный экстракт переносят в цен-
трифужные пробирки и центрифугируют при 3 000 об/мин в те-
чение 10 мин. Полученный экстракт используют в качестве ис-
ходного материала для определения глюкозы.
4.2. Получение безбелкового фильтрата.
В микропипетку набирают 0,5 мл полученного экстракта или
другого биологического раствора (например, крови или мочи),
вносят его в центрифужную пробирку и добавляют 0,5 мл 5%-ного
раствора трихлоруксусной кислоты. (Осторожно! Это едкое ве-
щество.) При наличии белка раствор мутнеет. Содержимое про-
бирки перемешивают, переносят в центрифужные пробирки и
центрифугируют при 3 000 об/мин в течение 5 мин. Белок при
этом осаждается. Безбелковый фильтрат (он должен быть про-
зрачным) сливают и используют для последующего анализа.
4.3. Количественное определение глюкозы.
4.3.1. Определение оптической плотности глюкозы в полу-
ченном фильтрате.
В микропипетку набирают 0,2 мл полученного фильтрата,
переносят его в высокую тонкостенную сухую пробирку и добав-
ляют 2 мл ортотолуидинового реактива (раствор о-толуидина в
уксусной кислоте). Работают осторожно, под тягой, так как
о-толуидин является ядовитым веществом. Пробирку закрывают
алюминиевой фольгой и помещают точно на 8 мин в кипящую
водяную баню, следя за тем, чтобы вода все время кипела. После
этого достают пробирку из водяной бани и быстро охлаждают в
токе холодной воды до 20ºС. Ее содержимое переносят в кювету
на 1 см и фотометрируют при длине волны 630 нм против рас-
твора сравнения. Полученные данные записывают в таблицу.
60
           4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
    4.1. Приготовление мышечного экстракта.
    На технических весах взвешивают 10 г мышечной ткани све-
жей рыбы или мяса и помещают в охлажденную, стоящую на
льду ступку. Отмеряют 50 мл охлажденного 0,04 М раствора ни-
котинамида и заливают им взятую навеску. Затем мышцы из-
мельчают ножницами, добавляют кварцевый песок, растирают
в ступке до получения гомогенной массы и экстрагируют
30–40 мин. После этого полученный экстракт переносят в цен-
трифужные пробирки и центрифугируют при 3 000 об/мин в те-
чение 10 мин. Полученный экстракт используют в качестве ис-
ходного материала для определения глюкозы.
    4.2. Получение безбелкового фильтрата.
    В микропипетку набирают 0,5 мл полученного экстракта или
другого биологического раствора (например, крови или мочи),
вносят его в центрифужную пробирку и добавляют 0,5 мл 5%-ного
раствора трихлоруксусной кислоты. (Осторожно! Это едкое ве-
щество.) При наличии белка раствор мутнеет. Содержимое про-
бирки перемешивают, переносят в центрифужные пробирки и
центрифугируют при 3 000 об/мин в течение 5 мин. Белок при
этом осаждается. Безбелковый фильтрат (он должен быть про-
зрачным) сливают и используют для последующего анализа.
    4.3. Количественное определение глюкозы.
    4.3.1. Определение оптической плотности глюкозы в полу-
ченном фильтрате.
    В микропипетку набирают 0,2 мл полученного фильтрата,
переносят его в высокую тонкостенную сухую пробирку и добав-
ляют 2 мл ортотолуидинового реактива (раствор о-толуидина в
уксусной кислоте). Работают осторожно, под тягой, так как
о-толуидин является ядовитым веществом. Пробирку закрывают
алюминиевой фольгой и помещают точно на 8 мин в кипящую
водяную баню, следя за тем, чтобы вода все время кипела. После
этого достают пробирку из водяной бани и быстро охлаждают в
токе холодной воды до 20ºС. Ее содержимое переносят в кювету
на 1 см и фотометрируют при длине волны 630 нм против рас-
твора сравнения. Полученные данные записывают в таблицу.


                             60

Страницы