Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии. Пластинина З.А - 47 стр.

пипетки градуированные на 1 и 5 мл;                               из каждой пробирки (в первую очередь из опытной, потом из
Реактивы: раствор казеина (10 мг в 1 мл). Навеску казеина         контрольной) по 0,5 мл содержимого в две тщательно
растворяют     в   небольшой     порции    0,1%-ного   раствора   вымытые пробирки. Опытную и контрольную пробы ставят в
карбоната натрия при осторожном нагревании, разбавляют            термостат и инкубируют в течение 2 ч, отбирая из них
дистиллированной водой и осторожно нейтрализуют 0,1 н.            аликвоты по 0,5 мл через 0,5; 1 и 2 ч.
раствором соляной кислоты; раствор трипсина (0,25 мг в 1                 В отобранных аликвотах проводят реакцию на
мл); 0,2М mpuc-HCl буфер (рН 8,0) смешивают 50 мл 0,4М            наличие свободных α - аминогрупп, для чего их помещают в
раствора триоксиметил-аминометана с 26,8 мл 0,4 н.                кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают до
раствора     соляной   кислоты     и   доводят   до    100   мл   комнатной температуры, после чего прибавляют по 0,5 мл
дистиллированной водой; буферный раствор для проведения           дистиллированной воды, 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5,4) и
нингидриновой реакции (рН 5,3—5,4 растворяют 270 г                0,5 мл нингидринового реактива. Содержимое пробирок
ацетата натрия в 200 мл дистиллированной воды, добавляют          тщательно перемешивают и помещают для развития окраски
50 мл перегнанной уксусной кислоты и доводят до 750 мл            в водяную баню при температуре 95°С на 7— —10 мин.
дистиллированной       водой);    нингидрин      (3%-ный)     в   Затем, не вынимая пробирок из бани, прибавляют в каждую
свежеперегнанном метилцеллозольве; изопоопиловый спирт            из них 5 мл 50%-ного раствора изопропанола.
(50%-ный).                                                               Оптическую плотность опытной пробы измеряют
                                                                  против контроля на фотоэлектроколориметре при длине
       В две пронумерованные пробирки вносят по 1 мл
                                                                  волны 507 нм (зеленый светофильтр).
0,2М трис-НС1 буфера, рН 8,0 и по 1 мл 1%-ного раствора
                                                                         Полученные     результаты     выражают   графически,
казеина. В одну из пробирок (опыт) приливают 1 мл 0,025%-
                                                                  откладывая по оси абсцисс время инкубации, по оси ординат
ного раствора трипсина, в другую (контроль) — 1 мл 0,025%-
                                                                  — значения оптических плотностей. Полученная кривая
ного   раствора     трипсина,    заранее    инактивированного
                                                                  наглядно   демонстрирует     динамику    высвобождения   во
длительным (не менее 1 ч) нагреванием на кипящей водяной
бане. Растворы хорошо перемешивают и немедленно берут