ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
После чего поместить в термостат на 30 мин при 30 °С. По истечению времени экстракции содержимое фарфоровых ступок
перенести на капроновый фильтр и хорошо отжать для отделения экстракта от биошрота (остатков питательной среды и
мицелия).
2. Определить влажность выросшей культуры, аналогично п.1 занятия 1 данной лабораторной работы, оформить табл.
4.4.
3. Осветлить полученный экстракт (вытяжку) путем центрифугирования. Для этого мерным цилиндром отмерить 25 мл
фильтрата и перенести в центрифужные стаканчики, которые устанавливают на роторе центрифуги попарно напротив друг
друга. Центрифугирование длится 5 мин при 3 тыс. оборотах. Осветленный экстракт слить в колбу для дальнейшего анализа.
4. Определить амилолитическую способность (АС) экстракта, используя капельный метод (по Климовскому и
Родзевич).
В основе метода лежит способность фермента амилазы, находящегося в вытяжке, катализировать гидролиз крахмала до
не окрашиваемых йодом продуктов.
Для определения АС важно строго соблюдать температурные условия реакции. Для этого все растворы – субстрат (1 %-
ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до 30 °С в ультратермостате в
течение 10 мин.
В широкую пробирку залить 25 мл раствора крахмала. Не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток
добавить воду, а затем вытяжку от 1 до 25 см
3
. Общий объем реакционной смеси должен составлять 50 см
3
. Если ферментная
вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см
3
, а воду вообще не добавлять.
Содержимое в пробирке перемешать палочкой и отметить время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к
раствору крахмала:
• каждые 60 с из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирать палочкой каплю пробы;
• каплю помещать на белую фарфоровую пластину, соединяя эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдать
окраску;
• реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при
соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 с;
• изменение окраски йода отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.
Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в
пределах 10…20 мин.
Если время гидролиза крахмала менее 10 мин, то определение повторяют, уменьшая объем вытяжки, а увеличивая
объем воды. Если гидролиз крахмала не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, увеличивая объем
ферментной вытяжки и уменьшая объем воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный
анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.
Например, если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность и количество ферментного
раствора 1…25 см
3
не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, для анализа берут не 25 см
3
раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например 10 или 40 см
3
, внося соответствующую поправку в
расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо обычных 0,25 г).
5. Рассчитать амилолитическую активность по формуле (4.2).
За единицу амилолитической активности (способности) принято такое количество фермента, которое катализирует
расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашваемых йодом, за 1 ч при температуре 30 °С в строго
определенных условиях:
()
WaT
AC
−⋅⋅⋅
⋅
⋅
⋅
=
1005
501006025.0
, (4.2)
где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 мл раствора, г;
60 – пересчет минут в часы; Т – время гидролиза, мин; a – количество ферментного раствора, взятое на анализ, мл; 100 –
количество экстрагирующей воды, мл; 5 – масса культуры, взятой на экстракцию, г; 50 – объем реакционной смеси; W –
влажность культуры гриба, %.
6. Результаты расчетов для различных вариантов питательных сред свести в табл. 4.5.
4.5. Результаты исследования
Состав среды, %
Вариант
среды
пшеничные отруби древесные опилки вода
Влажность
культуры, %
АС,
ед/г
7. Построить графики зависимостей амилолитической активности полученных методом твердофазного
культивирования ферментных препаратов от содержания пшеничных отрубей (крахмала) и влажности питательной среды.
Контрольные вопросы
1. Почему не рекомендуют выращивать в условиях твердофазного культивирования бактерии и дрожжи?
2. Какие параметры технологического процесса влияют на уровень накопления ферментов при твердофазном
культивировании микроскопических грибов?
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 30
- 31
- 32
- 33
- 34
- …
- следующая ›
- последняя »
