ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
3. Каким методом можно воспользоваться для выделения ферментов из поверхностной культуры?
4. Что представляет собой биошрот?
5. Какова химическая природа крахмала?
6. К какому классу ферментов относится амилаза? В чем заключается механизм ее действия?
7. Как определяют количество фермента в исследуемом образце?
8. Какая величина принимается за единицу активности фермента?
9. Как можно уменьшить или увеличить время гидролиза при определении амилолитической способности?
10. Как изменяется окраска реакционной смеси при добавлении раст-
вора йода в процессе реакции гидролиза крахмала?
Лабораторная работа 5
ВЛИЯНИЕ РЕЖИМОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ
НА ВЫХОД ГОТОВОГО ПРОДУКТА
Цель работы: изучение влияния условий осаждения на полноту выделения ферментов.
Теоретические предпосылки
Процессы выделения и очистки ферментов из таких сложных систем, как культуральная жидкость или экстракт
поверхностной культуры, преследуют цель получения концентрированной формы продукта и удаления сопутствующих
соединений, снижающих чистоту ферментного препарата. Эти процессы можно назвать "отделочными", так как они
обеспечивают получение ферментных препаратов и кристаллов ферментов разной степени чистоты в зависимости от
целевого назначения (для исследовательских целей, для пищевой промышленности, для медицинских целей, для
производства моющих средств и т.д.).
Практическое применение находят следующие способы выделения и очистки ферментов – осаждение органическими
растворителями, высаливание (сульфатом аммония, цинка, натрия, хлоридом натрия), изменение температуры, pH среды,
мембранные методы, разные виды хроматографии, электофорез, ультрацентрифугирование, ионообмен, адсорбция,
фильтрование.
Широкое распространение, в частности для выделения ферментов из водных растворов, получил метод осаждения
этанолом, изопропанолом и ацетоном. Добавление таких реагентов вызывает потерю растворимости белковых молекул и
сопровождается образованием осадка из-за снижения полярности среды в присутствии неполярных органических
растворителей. В водной среде энергия притяжения молекул фермента и диполей воды (энергия сольватации) превосходит
взаимное притяжение молекул фермента, в связи с этим образуется устойчивый раствор. При определенной концентрации
органического растворителя энергия сольватации становится меньше энергии связи между диполями воды и молекулами
растворителя, так как он обладает более сильной полярностью. В результате сольватная оболочка белковой молекулы
разрушается, что приводит к коагуляции белка и его осаждению.
Так как полярность различных растворителей различна, то и концентрация, вызывающая полное осаждение, будет
различна. Кроме того, ферменты по-разному относятся к концентрациям используемых для осаждения органических
растворителей, что часто дает возможность фракционировать комплекс ферментов.
Оптимальные условия осаждения определяются экспериментальным путем в каждом конкретном случае. Помимо вида
и концентрации органического растворителя, соли на процесс осаждения и сохранение активности ферментов в осадке
влияет присутствие в растворе электролитов, температура осаждения, концентрация сухих веществ в ферментном растворе,
их состав и т.д.
При выполнении лабораторной работы необходимо определить оптимальное соотношение экстракта и растворителя для
осаждения фермента, выход осадка по сухой массе, удельную активность осадка, потери активности, составить по
результатам исследований материальный баланс.
Порядок выполнения работы
Лабораторная работа выполняется на трех занятиях. На первом занятии производится посев Aspergillus oryzae для
получения поверхностной культуры, накопившей амилолитический фермент. На втором занятии проводится выделение
фермента методом экстрагирования. На третьем – осаждение амлолитического фермента органическими растворителями.
З а н я т и е 1
1. Приготовить субстрат из пшеничных отрубей (70 %) и опилок (30 %). Учитывая влажность субстрата увлажнить его
до 60 % влажности.
2.
Увлажненную массу перенести в коническую колбу, не загрязняя горлышка колбы. Колбы закрыть ватной пробкой,
бумажным колпачком и стерилизовать 30 мин при 120 °С в автоклаве. Содержимое колбы после стерилизации охладить при
интенсивном встряхивании.
3.
Засеять охлажденную стерильную питательную среду 1 мл суспензией спор гриба. После засева среду тщательно
перемешать путем встряхивания и пересыпать в стерильную кювету, закрыть крышкой и поместить в термостат.
Выращивание длится 48…54 ч при температуре 33 °С в течение первых 12 ч роста и 28…30 °С – в последующие.
З а н я т и е 2
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 31
- 32
- 33
- 34
- 35
- …
- следующая ›
- последняя »
