Биохимия зерна, биохимия хлебопечения- биохимия бродильных производств. Владимирова Е.Г - 8 стр.

     1.2 Лабораторная работа №2. Колориметрический метод определения
активности α- и β-амилазы

    Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высоко-
полимерного углевода - крахмала - с образованием декстринов и мальтозы. В
растениях встречаются α - и β -амилазы.
    Раздельное количественное определение активности α - и β -амилаз
основано на их различной термостабильности: β -амилаза разрушается
нагреванием до 70 °С, α -амилаза при этом сохраняет свою активность.
    Методы определения активности амилазы основаны либо на учете
количества сахара, образовавшегося при действии фермента на крахмал, либо
на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, которое
определяют фотометрически после обработки раствором иода.

    Реактивы: ацетатный буфер с рН 5,5;
              раствор хлорида натрия ω ( NаСl ) =1 %;
              раствор крахмала ω = 10 % , (2 г крахмала, размешанного в 20
см холодной воды, выливают в 80 см3 кипящей воды, после чего нагревают на
  3

кипящей водяной бане до просветления раствора);
             раствор соляной кислоты С(HCl) =1 моль/дм3
              раствор соляной кислоты С(HCl) =0,1 моль/дм3
              раствор йода ω = 0,3 % в 3 %-ном растворе йодистого калия.

     Навеску 0,5 - 1 г муки или проростков растирают в ступке с небольшим
количеством 1 %-ного раствора NаСl и переносят в коническую колбу на 50
см3. Соотношение между навеской и раствором NаСl 1:10 или 1:20.
Содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной
температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем фильтруют
через плотный складчатый фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать
фильтрование и центрифугирование при 4000-5000 об/мин. Прозрачный
раствор используют как ферментный препарат.
     Для определения активности α - и β -амилазы берут 4 пробирки (2
опытные и 2 контрольные) и вносят в них по 3 см3 ацетатного буфера и 3 см3
2%-ного раствора крахмала. Смесь нагревают на водяной бане или в термостате
до 40°С. Затем в опытные пробирки вносят по 0,2—1,0 см3 ферментного
препарата (в зависимости от активности амилаз в объекте изучения), а в кон-
трольные - такое же количество Н2О. Содержимое пробирок перемешивают и
ставят в термостат при 40 °С на 30 или 60 мин. После инкубации в каждую
пробирку сразу приливают по 2 см3 1 н. раствора НСl для прекращения
действия амилаз.
     Для выявления непрореагировавшего с ферментом крахмала проводят
реакцию с йодом. В мерные колбы на 50 см3 приливают около 30 см3 воды, 1
см3 0,1 н. НСl, 5 капель 0,3 %-го раствора иода и вносят из каждой пробирки по
0,5 см3 смеси. Содержимое колб хорошо перемешивают, доводят до метки

8